肠道微生物群引导肝细胞募集MDSC且促进

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背景

肠道和肝脏在解剖和生理上是相连的，“肝-肠轴”不仅控制肝脏病理，还控制肝内和全身免疫反应。因此，肠道微生物群是抗肿瘤免疫的重要调节因子。肠道屏障是分离肠腔微生物与宿主的第一道防线。不同肝病均被发现有肠屏障功能缺陷。肠屏障功能受损会增加肠道通透性，促进微生物产物甚至完整细菌转运进入门静脉循环。肠道微生物群组成改变(即“菌群失调”)与肠道屏障功能障碍有关，这两种情况在炎症性肠病(IBD)、原发性硬化性胆管炎(PSC)和肝硬化等中均常见，且都是胆管癌发生的危险因素。然而，关于生物代谢异常和肠屏障功能障碍对肝脏免疫和肿瘤发生的影响的了解还十分有限。

骨髓源性免疫抑制细胞(MDSCs)是一种不成熟骨髓细胞的异种群体，具有通过多种机制抑制适应性和先天性免疫应答的能力。最近的研究中描述胆管癌患者中MDSC的参与，并且建议在小鼠胆管癌模型中靶向PMN-MDSC可提高检查点抑制剂治疗的疗效。

简介

年12月15日，来自美国国立卫生研究院，国家癌症研究所，胃肠恶性肿瘤科的TimFGreten博士及其团队在CancerDiscov(IF:29.)杂志上发表名为GutmicrobiomedirectshepatocytestorecruitMDSCandpromotecholangiocarcinoma的研究[1]。本研究旨在探索肠道微生物群如何影响肝脏中的MDSCs。

主要结果

原发性硬化性胆管炎(PSC)和结肠炎中胃肠屏障受损会使肝脏暴露于肠道微生物群

在PSC患者中观察到了肠道菌群失调。我们检查了两种建立良好的小鼠PSC模型。使用胆管结扎法(BDL)在小鼠中模拟PSC样状态，或在Mdr2-/-小鼠中自发出现PSC样状态。如所报告的，肠道微生物群的测序揭示了来自BDL后小鼠的共生肠道细菌的不同谱(图1A)。如图1A所示，肠道共体在类水平上发生了深刻变化。特别是乳杆菌属、放线菌属和梭菌属的丰度差异。这些分类群似乎与对照样本中丰度较高的乳杆菌属和放线菌属以及BDL之后丰度相对较高的梭菌属呈负相关(图1A)。新的证据表明，代谢异常会导致PSC的肠屏障功能障碍。接下来，研究肠道的变化。显微镜分析显示BDL后小鼠出现慢性结肠炎体征，伴粘膜纤维化和杯状细胞减少。BDL小鼠的十二指肠、空肠、回肠和盲肠中紧密连接蛋白Occludin和ZO-1减少，而结肠中未观察到二者含量的差异(图1B)。炎性细胞因子mRNA水平(IL-1β、IL-17、IFN-γ、TGFβ、TNF-α、IL-10)显著升高，尤其是在BDL后小鼠回肠组织样本中(图1C)。这些结果表明，PSC的发展导致了小肠上皮的炎性反应和肠屏障功能的损害。接下来，我们研究了门静脉，它将血液从肠道排出到肝脏，从而在肝脏和肠道微生物群之间形成物理连接。实际上，在两种PSC样小鼠模型的门静脉血液中检测到较高的细菌16sRNA水平(图1D和1E)。我们还观察到口服给药后FITC标记的葡聚糖的血清水平显著升高，进一步支持了小鼠PSC样模型中受损的肠屏障功能(图1F和1G)。最后，检查肝组织是否存在移位细菌。电镀肝组织裂解物显示，PSC样病变小鼠的细菌菌落多于对照小鼠。

图1.PSC和结肠炎会导致肠道渗漏和细菌移位

共生的革兰氏阴性菌通过TLR4依赖机制引起肝MDSC蓄积

接下来对PSC样病变小鼠肝脏中的免疫细胞亚群进行了研究。与其他免疫细胞相比，BDL引起肝CD11b+Gr-1+髓系细胞的稳健累积(图2A)。CD11b+Gr-1+髓系细胞主要由CD11b+Ly6G+Ly6Clow多形核髓系细胞组成，其次为CD11b+Ly6GnegLy6Chigh单核细胞。在Mdr2-/-小鼠中，流式细胞术还发现肝CD11b+Ly6G+Ly6Clow细胞增加(图2B)。为证实这些发现，免疫组织化学分析显示Mdr2-/-小鼠肝脏中Ly6G+细胞增加(图2C)。为了评估PSC样病变诱导的髓系细胞是否表现出免疫抑制功能，我们分离了肝脏CD11b+Gr1+髓系细胞，并在体外测试它们抑制CD8+T细胞增殖的能力。实际上，CD8+T细胞增殖受到BDL-PSC招募的肝髓样细胞的抑制(图2D)，证明这些CD11b+Gr-1+细胞是MDSCs。此外，在伴有PSC样病变的小鼠中观察到CD69+CD8+和颗粒酶B+CD8+肝T细胞较少。使用1A8抗体耗竭PMN-MDSC可显著性提高肝组织中TNF-α+CD8+T细胞、IFN-γ+CD8+T细胞和CD69+CD8+T细胞的频率。最后，我们研究了DSS诱导的结肠炎小鼠的肝脏，并观察到类似结果。BDL结扎后小鼠和Mdr2-/-小鼠中的MDSC蓄积不限于肝脏，在脾脏、肠道和肺中也观察到，BDL结扎后小鼠中发现肺组织中细菌16sRNA增加。

图2.LPS/TLR4诱导肝脏中的MDSC蓄积

肝细胞通过LPS/TLR4/CXCL1介导MDSC蓄积

CXCR2是关系到中性粒细胞募集到炎症部位和MDSC蓄积的重要受体。在C57BL/6小鼠中，约95%的CD11b+Ly6G+Ly6Clow多形核髓样细胞表达CXCR2，而约5%的CD11b+Ly6GnegLy6Chigh单核细胞髓样细胞CXCR2呈阳性(图3A)。BDL和DSS治疗导致肝脏CXCR2+细胞显著性增加(图3B和3C)。PMN-MDSC约占肝CXCR2+白细胞的85%(图3D)，BDL和DSS治疗后CXCR2+细胞中PMN-MDSC的百分比增加(图3E)。CXCL1是小鼠CXCR2的主要配体。因此，我们研究了PSC样病变和结肠炎小鼠肝脏中CXCL1的表达。BDL、Mdr2-/-和DSS-结肠炎小鼠肝脏中CXCL1mRNA水平显著性升高(图3F)，肝脏中CXCL1高表达导致肝PMN-MDSC蓄积(图3G)。如预期，CXCL1抗体中和降低了肝脏PMN-MDSC和总MDSC(图3H)，表明CXCL1上调介导了PSC样病变和结肠炎小鼠肝脏中PMN-MDSC的蓄积。在BDL诱导的PSC样病变和DSS诱导的结肠炎模型中使用强效和选择性CXCR2抑制剂SB时，也获得类似结果(图3I)。总之，这些数据表明CXCL1/CXCR2轴调节肝脏中的PMN-MDSC蓄积。

图3.肝细胞通过LPS/TLR4/CXCL1介导MDSC蓄积

原发性硬化性胆管炎(PSC)和结肠炎促进胆管癌的发生

PSC是胆管癌的重要危险因素，临床证据显示结肠炎与胆管癌呈相关。使用两个成熟的小鼠胆管癌模型，我们接下来检测了PSC或结肠炎小鼠模型是否会促进胆管癌。通过流体动力注射递送编码活化的AKT和YAP或AKT和Notch1的质粒，导致4周后形成胆管癌。显微镜分析显示肿瘤病变具有胆管癌的组织学特征。在注射AKT和YAP后胆管结扎小鼠中发现较大肿瘤(图4A)。此外，本研究还建立了胆管癌细胞株LD1。LD1细胞系的拷贝数变异(CNV)测序表明存在包括AKT和YAP在内的各种突变。在BDL-PSC小鼠中，原位植入的胆管癌肿瘤生长更快(图4B)。我们还检测了将AKT和YAP递送到Mdr2-/-小鼠中的情况，并再次注意到PSC样病变促进了胆管癌的生长(图4C)。在结肠炎小鼠中也发现了类似结果。在动力注射AKT和YAP(图4D)或AKT和Notch1(图4E)的DSS治疗小鼠中发现了更多的肿瘤负荷。最后，在第二个结肠炎小鼠模型(由2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)诱导)以及不同小鼠品系和不同性别中也观察到胆管癌的加速生长。这些证据表明，在这些小鼠模型中，PSC和结肠炎均促进了胆管癌的生长。

图4.PSC和结肠炎促进胆管癌的发生

肠道微生物群引导肝细胞调控胆管癌

进一步研究了肠道微生物群在肝脏和肿瘤生长中对MDSC的特定作用。新霉素治疗用于消除肠道中的革兰氏阴性菌，以减少BDL小鼠(图6A-C)和DSS-结肠炎小鼠中的胆管癌。为了消除肠道微生物群对肝肿瘤生长的影响，我们使用抗生素治疗在无菌小鼠肠道中重复了粪便移植研究，并在没有结肠炎或PSC样病变的情况下监测了肝内注射的RIL肿瘤细胞的肿瘤生长(图6D)。在使用万古霉素治疗的小鼠粪便定殖的小鼠中发现了更高的肿瘤负荷(图6E-6G)，这伴随有较高数量的肝脏浸润PMN-MDSC。有趣的是，在没有PSC样病变或结肠炎的情况下，使用抗生素合剂(ABX，0.5g/L万古霉素、0.5g/L新霉素和0.5g/L伯氨蝶呤)进行肠道灭菌并未减少胆管癌的生长。缺乏效果可能是由于在没有肠管渗漏的情况下，PMN-MDSC数量较低。

图6.肠道微生物群引导肝细胞调控胆管癌

结论及展望

综上所述，本研究结果表明，革兰氏阴性菌/LPS通过TLR4依赖性CXCL1的产生，来诱导CXCR2+PMN-MDSC蓄积，以控制肝细胞形成免疫抑制微环境，从而促进肝脏肿瘤的生长。该发现并不局限于PSC或结肠炎促进型胆管癌，也适用于其他暴露于肝脏-肠道微生物群增加的肝脏肿瘤。我们的研究还表明，肠道细菌是伴有潜在慢性胃肠道疾病的肝癌的一个预防和治疗靶点。

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