十二指肠直肠菌群分析

人体肠道被认为是人的第二大脑”，其内寄生着大量的微生物如细菌、病毒

和原生动物。在人体肠道内含有超过10^14个大约-种细菌，这些数量繁多、种类丰富的细菌在肠道功能中起着重要的作用，如参与肠道免疫、肠神经的发育、消化吸收、抵抗致病菌的定植等等。另外，肠道菌群还广泛的参与到多种疾病的发生发展中。研究发现，肠道菌群与炎症性肠病结直肠肿瘤、肥胖、糖尿病、精神心理性疾病及IBS等的发病相关。根据细菌在肠道栖息的位置不同，肠道菌群分为生活在肠液或者粪便中的腔内菌和粘附在肠上皮细胞或在其分泌的粘液层中的粘膜菌。此外，不同肠段内细菌因为其所处微环境的不同可能呈现不同的分布特点。文献证实，回肠末端、升结肠、降结肠、乙状结肠、直肠和粪便中的细菌组成是不同的。但是，由于十二指肠细菌少，且十二指肠标本不易于采集，因而关于十二指肠细菌的研究相对较少，到目前为止，尚缺少运用二代高通量测序研究十二指肠细菌的研究报告。

于是在一项研究中，研究人员通过募集健康志愿者和腹泻患者，采集其十二指肠及直肠粘膜以及粘液和粪便，运用高通量测序方法和多种生物信息学分析方法，对中国腹泻型肠易激综合征患者肠道菌群的特点进行初步的探讨，为中国肠易激综合征的肠道微生态研究提供了一点基础。

他们首先探讨了正常人中的十二指肠与直肠菌群的大体差异，通过招募成年健康志愿者10名，成年腹泻型肠易激综合征患19名，收集一般资料，采集新鲜大便，并经胃镜、肠镜下釆集十二指肠液及十二指肠、直肠粘膜各块，上述标本处理后应用焦磷酸测序平台检测，并使用指数、系统发育指数和主坐标分析等多种生物信息分析方法来比较不同部位细菌的差异。他们发现无论是十二指肠的腔内菌还是粘膜菌的多样性均高于直肠的。粘膜菌群相对于腔内菌更为稳定。

然后接着探讨肠易激综合征患者不同部位肠道菌群特点及菌群与症状的关系，结果发现十二指肠菌群改变以蓝菌门、梭杆菌门和拟杆菌门为主；直肠菌群改变以变形菌门、绿弯菌门、拟杆菌门和厚壁菌门为主。正常人十二指肠常见优势菌属分别为嗜糖假单胞菌属、拟杆菌属、柔嫩梭菌属、普氏菌属、狭长平胞属、链球菌属；患者十二指肠常见的优势菌属分别为赖氨酸芽孢杆菌属、拟杆菌属、苍白杆菌属、链球菌属、颗粒链菌属、狭长平胞属。正常人直肠常见的优势菌属分别为拟杆菌属、普氏菌属、柔嫩梭菌属；患者直肠常见的优势菌属分别为拟杆菌属、普氏菌属、水栖菌属、柔嫩梭菌属。患者的腹胀与肠道中的芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌、丙酸杆菌属、罗尔斯通氏菌属、不动杆菌属、埃希氏菌属等比例升高和柔嫩梭菌属、乳酸杆菌属、嗜糖假单胞菌属、普氏菌属、链霉菌属、等的比例降低相关。IBS患者的腹痛与肠道中的芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌、罗尔斯通氏菌属、不动杆菌属、埃希菌属等的比例升高和柔嫩梭菌属、乳酸杆菌属、嗜糖假单胞菌属、普氏菌属、狭长平胞属、链霉菌属、等的比例下降相关。所以中国患者肠道菌群存在失调，其菌群变化具有自己的特点，临床症状与肠道菌群失调有关。

由于便粪和大肠的样品易于被釆集，目前大多数研究集中于粪便和大肠中的菌群。相反，十二指肠及以下的小肠由于采样困难，所以关于十二指肠菌群的研究较为有限。研究发现，十二指肠菌群不但参与上消化道的许多生理作用环节，其还与和乳糜泻等疾病密切相关（。十二指肠因为处于胃和空肠的中间地带，其微环境较为复杂（酸与碱混合），这决定了十二指肠细菌同样比较复杂。虽然既往有少量涉及十二指肠菌群的研究，但是这些研究所采用分析细菌的方法如变性电泳凝胶、原位光荧杂交、实时荧光PCR和终端限制性片段多肽等主要聚焦于样品中的优势菌群，丢失相对比例较少菌群的信息，因而相对局限（严重影响了十二指肠菌群的多样性，导致不能全面认识十二指肠菌群的特点和作用。另外，粘膜菌群和腔内菌群（如粪便中）分布位置不同，所处环境不同，两者稳定性可能不同。目前关于基于粪便菌群分析的“肠型”概念一直备受质疑，因为研究发现腔内菌容易受饮食影响较大。那么有没有相对稳定一点的菌群可用作“肠型”的界定呢？我们推测粘膜菌群因为附着在黏膜或者粘液层，其可能受到外界环境影响相对较少，但目前尚无这方面的研究。基于上述存在的现状与问题，本研究应用第二代高通量测序平台，联合多个区进行正常人和患者的十二指肠菌群和直肠菌群（包括粘膜菌群和腔内菌群）的对比分析，来阐明十二指肠菌群的特点及粘膜菌群和腔内菌群的稳定性的差异，从而为进一步研究十二指肠菌群在人类健康和疾病中的生理病理作用提供方法与基础。

数据表明，无论是在正常人还是患者中，肠道中粘膜菌的变化率要小于腔内菌，这提示沿肠道分布的粘膜菌的组成可能相对保守，比腔内菌更加稳定。

既往研究发现，粪便中可培养的细菌总数要远远多于十二指肠抽取物中的。

因此，人们可能认为粪便菌群的多样性要高于十二指肠的。然而，我们通过高通量测序并运用多种如多样性、系统发育多样性等分析方法发现，在正常人中无论是粘膜细菌还是腔内菌，十二指肠的多样性显著高于直肠的。这与国外的研究发现是相反的。该项研究通过运用变性电泳凝胶方法来研究十二指肠粘膜和粪便里面的菌群情况并发现十二指肠粘膜菌群的多样性低于獎便菌群。但是，正如所述的一样，这种变性电泳凝胶方法只能检测到样品中的优势菌群，那些非优势细菌的信息被丢失掉了，因而检测样品中细菌的多样性下降。另外一项使用高通量测序的研究发现，口腔细菌的多样性是最高的，而十二指肠粘膜菌群的多样性似乎高于直肠和粪便中的，但是这项研究中仅包含29个十二指肠样本，结果多样性指标的差异没有统计学意义。的确，

我们通过对正常人和患者大样本的研究发现，不但十二指肠粘膜细菌的多

样性高于直肠粘膜的，而且十二指肠腔内菌的多样性也高于直肠腔内菌。为什么十二指肠菌群多样性会髙于直肠的？一个很生动的解释如下：人体肠

道菌群就像“马拉松长跑运动员”，这些“运动员”来自如口腔、食物、水、胃，甚至是胆囊等全国各地，然后经过胃酸和人体免疫系统等的严格“缔选’’，终于来到肠道的起点十二指肠然后开始它们在肠道里面的“长跑竞赛”。随着菌群在肠道“跑的距离”以及到达的肠道微环境（厌氧环境及肠道免疫环境），越来越少的细菌“坚持下来”并最终到达大肠，而大肠回馈给这些细菌的“奖励”则是缓慢的暢动和大量的“食物”。因此，这些细菌具备了大量繁殖的条件从而形成了多样性低但数量巨大的菌群特点。此外，我们发现患者的十二指肠腔内菌的多样性也要高于直肠的，但是十二指肠粘膜菌的多样性与直肠的没有显著的差异，这表明患者肠道菌群发生了改变。既往文献报道，运动可以增加粪便菌群的多样性，而运动又对人体是有益的，同时，疾病和年老都会导致人体细菌多样性的下降，似乎肠道菌群的多样性越高，人体可能更加健康。众所周知，肠道细菌基本是经口定植到肠道，那么十二指肠细菌的多样性可能影响直肠（或类便）细菌的多样性，因此十二指肠细菌的多样性可能在婴儿或儿童时期对肠道菌群及肠道免疫起着非常重要的作用。近来研究还发现一些如哮端、过敏、食物不耐受等疾病可能也与肠道菌群相关。而小肠免疫在人体肠道免疫中十分重要，推测十二指肠细菌在这些疾病中可能起着非常重要的作用，这也许可以成为这类疾病的一个研究方向。

我们的结果还显示，十二指肠的粘膜菌群和腔内菌的总的菌门数和菌属数均多于直肠的，这从另一个侧面也证实了十二指肠细菌的多样性高于直肠的。此外，在同一个个体里，与十二指肠和直肠的腔内菌相比，十二指肠和直肠粘膜菌群拥有更多数量相同的种类，这表明人体肠道内粘膜细菌的稳定性要优于腔内菌。其他的研究也发现，肠道粘膜细菌在高一级分类学水平的组成具有较

高的相似性，这与我们的结果相似。因此，我们推测，粘膜细菌可能比腔内菌更稳定，可能受到急剧变化的肠内环境的影响较小一些。近来，一些研究者

认为，由于个体间的差异较大，因而需要重新思考“肠型”的界定。根据我们的

结果显示，与肠道的腔内菌相比，粘膜细菌更加稳定。因而粘膜细菌可以作为“肠型”分类的一个候选。肠道细菌与肠道粘膜免疫之间是相互作用，一方面肠道细菌影响着肠道粘膜免疫，另一方面肠道粘膜免疫控制着肠道菌群，两者相辅相成，肠道粘膜菌相对稳定的特点可能使其成为反映人体免疫状态的风向标。

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